Fungal GH6 Cellulases: A Biochemical Study of Fungal Cellobiohydrolases from Glycoside Hydrolase Family 6

Omdannelsen af cellulose til opløselige sukre er altafgørende, for at
kunne producere lignocellulose-baseret biobrændsel, som er et
bæredygtigt og miljøvenlige alternativ til fossile transportbrændstoffer. I
naturen omdanner svampe og andre organismer cellulose til opløselige
sukre, som derefter kan optages og anvendes som nærringskilder. Denne
proces foregår ved, at svampen udskiller en sammensætning af
cellulosenedbrydende enzymer (cellulaser), som er i stand til at nedbryde den
stabile og genstridige cellulose. Ved fremstilling af cellulosebaseret
biobrændsel og biokemikalier anvendes lignende enzymblandinger,
for at omdanne cellulose til fermenterbare sukre. En vigtig komponent i
denne blanding er cellobiohydrolaser (CBH’er) fra Glykosid Hydrolase
(GH) familie 6. Større indsigt og viden om denne enzymfamilie vil derfor
gavne en fremtidig implementering af biomassebaseret brændstof og
kemikalier. I det forestående arbejde, har vi belyst funktionen af denne vigtige
enzymfamilie ved en grundig biokemisk karakterisering af både
forskellige vildtypeenzymer og varianter.
Cellulaser adskiller sig fra mange andre industrielle enzymer, idet de angriber
et krystallinsk uopløseligt substrat (cellulose), og enzymerne arbejder
dermed i grænsefladen mellem væske og fast stof. Af den grund kan
klassisk enzymkinetik ikke anvendes til at beskrive cellulaser, ikke mindst
fordi der er flere udfordringer forbundet med bestemmelse af steady-state
hastigheden. I denne afhandling foreslår vi en praktisk metode til at
bestemme netop steady-state hastigheder for cellulaser. Ved at benytte
denne, samt anvende steady-state modeller udviklet til denne type enzymer,
kunne vi udlede informative kinetiske parametre for disse enzymer.
Et særligt fokus blev rettet mod modelenzymet TrCel6A fra Ascomyceten
Trichoderma reesei. Vi udførte pre-steady-state kinetik på dette enzym, og fandt at enzymet har en burst-fase i den indledende del af den katalytiske reaktion. Baseret på denne observation foreslår vi, at det hastighedsbestemmende trin for den overordnede enzymreaktion er dissociationen fra cellulosesubstratet. Vi foreslår, at dette enzym følger den såkaldte ”obstacle-” teori, hvor uproduktive enzymer akkumuleres foran ujævnheder på substratoverfladen. Vi fandt en hydrolysehastighed på mindst 25 s-1 for TrCel6A, hvilket er den hurtigste hastighed rapporteret for cellulaser hidtil. Dermed er TrCel6A et hurtigt enzym, men hvis det sammenlignes med den relaterede CBH fra GH7 familien TrCel7A, fremgår det at TrCel6A har en svag cellulose adsorption. Dette medfører at evnen til at finde og angribe cellulosekædeender (kaldet ”attack sites”) er ringe sammenlignet med TrCel7A. Disse forskelligheder kan muligvis forklares ved at TrCel6A har en kortere og mere åben katalytisk tunnel, hvilket medfører højere dynamik, men til gengæld forringet interaktion mellem enzymet og cellulasekæden.
Mange GH6 cellobiohydrolaser har et kulhydrat bindende modul (CBM) hæftet
til deres katalytiske domæne (CD). Disse moduler er kendt for at forstærke
bindingen til cellulose, hvilket også fremgik af vores data. For at belyse dette
yderligere designede vi varianter af TrCel6A hvor CBM’en var udskiftet med en
CBM fra andre GH6 enzymer der stammer fra andre svampe. Gennem disse
varianter demonstrerede vi, at forskellige CBM’er påvirker cellulose adsorption
og hydrolyse forskelligt og at TrCel6A adsorberer stærkest til cellulose med sin
naturlige CBM.
Centralt for denne afhandling var også en biokemisk sammenligning af GH6
vildtypeenzymer fra seks forskellige cellulosenedbrydende svampe. Disse GH6
enzymer udviste betragtelig funktionel forskellighed både hvad angår cellulose
affinitet og kinetik. Der var en klar skalering mellem affinitet og den katalytiske
hastighed for de testede enzymer, hvor de kinetiske parametre udviklede sig
mellem to yderligheder. Nogle enzymer var karakteriseret ved høj cellulose
affinitet, god evne til at lokalisere attack sites og lav katalytisk omsætning, mens
andre modsat var karakteriseret ved lav affinitet, dårlig evne til at lokalisere
attack sites, men en hurtig katalytisk omsætning. Det omtalte fænomen, hvor
enzymer er begrænset til at udvikle sig mellem de to ekstremer, kan forklares ud
fra et evolutionært perspektiv, hvor svampen tilpasses til de betingelser den
udsættes for. Vi fandt, at enzymerne med stærk adsorption var gunstige ved høje industrielle temperaturer, idet de både var mere stabiliseret af substratet og mere termoaktiveret.