Kryopræservering med hyperaktive antifryseproteiner

Dennis Friis

Studenteropgave: Speciale

Abstrakt

At kunne opbevare biologisk materiale, såsom celler, i længere tid uden for organismen, uden tab af viabilitet, er et vigtigt element i sygdomsbehandling. En ofte anvendt metode i denne sammenhæng er kryopræservering, selvom der er en række problemer forbundet med denne metode. Under kryopræservering af biologisk materiale udsættes cellerne for en række skadelige processer. En af disse processer er en dynamisk omstrukturering af iskrystallerne kaldet rekrystallisation. Antifryseproteiner (AFP), der indgår som et adaptivt forsvar mod isdannelse i en række forskellige organismer, har vist sig at modvirke rekrystallisation. Det er derfor blevet undersøgt i fryseforsøg, om proteinerne i kraft af denne egenskab, kan forbedre cellers overlevelsesmuligheder ved kryopræservering. Indtil videre er kun AFP fra fisk blevet undersøgt i denne sammenhæng, og disse har vist sig kun at være fordelagtige ved lave koncentrationer. Ved høje koncentrationer forårsager proteinerne skadelig spikulær isvækst, hvilket skader cellerne, og nedsætter overlevelsen kraftigt. AFP fra insekter binder til is på en anden måde, og forårsager ikke denne skadelige form for isvækst. I dette projekt blev der undersøgt, om AFP fra insekter kunne anvendes til kryopræservering med større succes. Suspenderede nyreceller af cellelinjen A6 blev kortvarigt kryopræserveret i ringermedie med 10 % DMSO ved -196 °C. Mediet var tilsat forskellige proteinopløsninger, herunder AFP fra billen Rhagium mordax, kontrolproteinerne Glutathion-S-Transferase (GST) eller albumin (BSA) eller en blanding af både GST og AFP. Efter kryopræserveringen blev cellernes viabilitet bestemt via farvning med trypan blå. I forsøgene blev parametre, der er særligt vigtige for cellernes overlevelsesmuligheder, kontrolleret, og nogle af disse blev varieret forsøgene imellem, for at undersøge hvilke skadelige processer AFP havde indvirkning på. Resultaterne viste, at tilsætning af AFP medførte enten en klar forbedring af overlevelsen eller en klar forringelse. Opfølgende forsøg viste, at denne observation sandsynligvis kunne relateres til en varierende grad af underafkøling, der skete i prøverne, før isdannelsen indtræf. Underafkøling associeres med en forbedring af overlevelsen, mens manglen på samme medfører en forringelse. En modsat tendens blev observeret for kontrolproteinerne. Dette tyder på at AFPs effekt er relateret til dynamikken omkring isdannelsen, og at denne effekt er proteinspecifik. Resultaterne viste også, at prøver med AFP beholdte en stabil overlevelsesrate, selvom varmeraten blev sænket, og omfanget af skadelig rekrystallisation normalt ville øges. I prøver uden AFP havde en lav varmerate større konsekvens for overlevelsesraten. Det blev også påvist at høje koncentrationer af AFP kunne med fordel anvendes, og bekræfter altså hypotesen om, at man ved brug af AFP fra insekter, kan undgå den skadelige ismorfologi, der følger med høje koncentrationer af AFP fra fisk. Udfordringen er nu at kunne styre den umiddelbare tilfældige opdeling af overlevelsesraterne, som disse forsøg viser, der følger med brugen af AFP fra insekter. Hvis dette lykkedes, kan AFP fra insekter med fordel anvendes til kryopræservering frem for AFP fra fisk. Forsøgene viste også, at GST, som blot var tiltænkt at fungere som kontrolprotein, havde en stabil positiv effekt på cellernes overlevelsesrater. Proteinets funktion er at neutralisere reaktive elektrofile komponenter, og den positive effekt, der blev observeret i kryopræserveringen, er sandsynligvis forbundet med dette. GST yder dog ikke beskyttelse mod rekrystallisation i samme grad som AFP, så disse to proteiner kan med fordel kombineres. GST og AFP har altså her vist, at kunne forbedre kryopræserveringen af celler på forskellige måder, og det må forventes at flere andre proteiner ligeledes kan have en gavnlig effekt. At inddrage specifikke proteiner i kryomedier ser derfor ud til at være en god mulighed for at forbedre fremtidige præserveringer.

UddannelserMolekylærbiologi, (Bachelor/kandidatuddannelse) KandidatMedicinalbiologi, (Bachelor/kandidatuddannelse) Kandidat
SprogDansk
Udgivelsesdato6 jul. 2010
VejledereHans Ramløv & Henning F. Bjerregaard

Emneord

  • Cryopreservation
  • A6
  • Antifreeze proteins
  • AFP