Investigations of Structure and Dynamics of Insulin Mutants using NMR Spectroscopy

Helle Birk Olsen

    Publikation: Bog/antologi/afhandling/rapportPh.d.-afhandlingForskning

    Abstract

    Nærværende ph.d. afhandling omhandler NMR (kerne magnetisk resonans) spektroskopiske undersøgelser af struktur og dynamik af en række mutanter af human insulin. Projektet blev udført som en erhvervsforskeruddannelse i et samarbejde mellem Novo Nordisk A/S, Roskilde Universitetscenter og Akademiet for de Teknisk Videnskaber (ATV). Den insulinkrzvende (Type 1) diabetes mellitus er karakteriseret ved en stærkt nedsat eller fraværende produktion af endogen insulin. Patienter med denne kroniske sygdom behandles med subkutane injektioner af insulinpræparater en eller flere gange dagligt for at opretholde et nogenlunde normalt blodsukkerniveau. Pa Novo Nordisk forskes til stadighed i at udvikle denne injektionsterapi til sB pracist som muligt at efterligne kroppens normale insulinprofil. Et meget attraktivt langsigtet formål er at udvikle et insulinmimetika, som kan indgives peroralt. Derfor er der i de seneste ar udført forskning med henblik på at karakterisere bindingsområderne pa insulinreceptoren. Parallelt hermed søges sammenhængen mellem forskellige insulin mutanters variable affinitet for insulinreceptoren og deres tre-dimensionelle struktur klarlagt, her-under borer undersøgelse af de strukturændringer som følger af insulins binding til receptoren. Dette projekt er iværksat som en del af denne klarhegning. Insulin består af 51 aminosyre rester fordelt pi to kæder, A-kæden best& af 21 rester og Bkaden bestir af 30 rester. De to kæder er indbyrdes forbundet af to svovlbroer, A7-B7 og A20-B19. herudover tindes en svovlbro internt i A-kæden, A6-All. Den rumlige struktur af insulin molekylet er grundigt undersøgt vha. Røntgen-krystallografi. I nærver af zinc krystalliserer molekylet i hexameraggregater sammensat af tre ens dimerer. Den biologisk aktive konformation af insulin er imidlertid monomeren. En række komplicerede aggregerings- og opløseligheds-forhold vanskeliggør detaljerede strukturstudier vha. NMR spektroskopi af den native monomer i det fysiologiske pH omride. Ved at indføre substitutioner af aminosyre rester i begge aggregeringsflader har det imidlertid vist sig muligt at fremstille en mutant af human insulin, som er monomer netop i det onskede pH omrbde. Den biologiske aktivitet af mutanten er 47 % af den oprindelige. Den tre-dimensionelle struktur af (Bl. BlO, B16, B27) Glu, des-B30 mutanten blev bestemt ved pH 6.5. Strukturen er generelt veldefineret. rms (root mean square) for backbone i områderne A2-A19 og B4-B26 er 0.66 A. Strukturen i opløsning adskiller sig kun lidt fra krystalstruktureme. A-kreden består af to antiparallelle helix omrader, A(I)-helixen, A2-A8, og A(II)-helixen, A12-A19, forbundet af et loop. I B-kaden er Bl-B3 uordnede, B4-B8 danner et loop til den centrale a-helix, B9-B19, herefter ses et type I turn, B20-B23. som fortsætter i en P-struktur, resterne B27-B29 er uordnede. Fælles for denne struktur og strukturen af andre insulin mutanter bestemt i sur opløsning, er et veldefineret kemeområde. som består af Både helixen og hele A-kæden. Den sekundære såvel som den tertiære struktur i dette kemeområde er bevaret gennem hele serien af strukturer. Forskelle mellem struktureme findes primært i de terminale dele af B-kaden. Sammenlignet med strukturen af B16 His mutanten, som denne struktur ligner mest Helle Birk Olsen Insulin Structure i serien af mutanter, bevirker indsættelsen af de ladede Glu sidekseder en ringere præcision af strukturen i begge B-kade terminaler. Mærkning af de to insulin mutanter (Bl, BlO, B16, B27) Glu, des-B30 og B16 His, des-B30 med den NMR-aktive nitrogen-isotop ‘“N muligør bestemmelse af relaxationsparametrene, T, og Tz, samt NOE’en for ‘-‘N kernerne i backbone. Disse relaxationsparametre kan oversættes til en generaliseret ordens parameter, som er et udtryk for den rumlige begrænsning af NH bindingens bevægelse pa pica-nanosekund tidsskalaen. For begge mutanter ses en fin korrelation mellem præcisionen af den beregnede strukturs backbone og dynamikken her. Terminalerne i B-kæden udviser stigende dynamik mod enderne, hvilket reflekteres direkte i faldende strukturel definition i de samme omrider. De to mutanters forskellige generelle strukturelle precision afspejles perfekt i deres overordnede dynamik niveauer. Endvidere observeres millisekund tidsskala dynamik i området omkring svovlbroerne A7-B7 og A6-All ved neutral pH, dette tages som en indikation for isomeri omkring svovlbindingerne i broerne. Ved surt pH er dynamikken pa denne tiddskala spredt ud over samtlige sekundære strukturelementer. A(I)-helix omridet er en de1 af et af insulins formodede receptor bindings-omrbder, mutationer i dette omrdde indvirker kraftigt pa den biologisk aktivitet. I fortsættelse af (Bl , Bl 0, B16, B27) Glu, des-B30 insulin mutanten er to mutanter med en ekstra mutation, A3 Gly hhv. A8 His, som giver 0.1 % hhv. 143 % biologisk aktivitet ii-emstillet. Begge mutanter er monomere under eksperimentelle betingelser svarende til basis mutantens. Den tre-dimensionelle struktur af de to mutanter er endnu ikke beregnet, men resultaterne af de indledende NMR undersøgelserne viser som ventet markante forskelle i A2-A8 omrbdet. For A8 His mutanten ses en klar stabilisering af helixen i området, herudover ses semi strukturelle ændringer i den de1 af B-kæden, som ligger rimeligt tæt herpå, især B9. For A3 Gly mutanten er alle tegn pa helix i A2-A8 området forsvundet, dette indvirker ikke kun pa strukturen i området omkring B9, men også pH strukturen i den C-terminale de1 af B-kæden og i nogen grad på den centrale B-helix.
    OriginalsprogEngelsk
    Udgivelses stedRoskilde
    ForlagRoskilde Universitet
    Antal sider80
    StatusUdgivet - 1996

    Citer dette